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会员内部六肖中特网:人牙周膜成纖維細胞對鹽酸林可霉素跨膜轉運的色譜情況

時間:2014-08-27 來源:未知 作者:學術堂 本文字數:2818字
論文摘要

六肖中特免费公开109 www.cffyz.icu   牙周炎、冠周炎等牙科疾病嚴重危害人類健康,也給患者帶來極大痛苦[1].該類疾病的發作與厭氧菌感染相關,抗生素的應用十分普遍.林可霉素屬于對多數厭氧菌、需氧菌有較強抗菌作用的廣譜抗菌藥,通過阻斷敏感菌核糖體的膿鏈延長來達到掏細菌細胞蛋白合成的作用.林可霉素早期被應用于骨髓炎、骨和關節感染、敗血癥等的臨床治療中,并取得一定療效[2],其應用于牙周疾病的治療方面效果如何,目前報道尚少.本研究探討了人牙周膜成纖維細胞(HPDLF)對鹽酸林可霉素跨膜轉運的色譜情況,旨在為牙周局部和全身給藥提供實驗數據.

  1 材料與方法

  1.1 試劑與設備

  高糖DMEM培養基和胎牛血清由美國GIBCO公司提供,胰蛋白酶由美國Amresco公司提供,杭州四季青新生牛血清由浙江天杭生物科技有限公司提供,鹽酸林可霉素由美國Fluka公司提供.細胞培養皿由美國Coring公司提供,Agilent 1100 LC高效液相色譜儀由美國Technologies公司提供,圖像分析系統由德國萊卡公司提供,JY98超聲細胞粉碎機由寧波新芝生物科技股份有限公司提供.高效液相色譜法(HPLC)應用試劑為色譜純,其它細胞培養試劑為分析純.

  1.2 HPDLF細胞培養

  在患者同意的情況下,取我院11~24歲年齡段行正畸治療時需拔除的健康前磨牙,以無菌生理鹽水和培養基沖洗,取牙根中部1/3處進行牙周膜組織刮取,剪成碎屑并置入高糖CMEM培養基(含15%胎牛血清)貼壁培養,培養條件:飽和濕度、5%二氧化碳、37℃,3h后翻瓶.

  傳代HPDLF細胞大量繁殖后,取6~10代用于本組實驗.MC3T3-E1細胞常規培養,飽和濕度、5%二氧化碳、37℃培養條件下于高糖DMEM培養基(含10%新生牛血清)培養[3~4].

  1.3 樣品制備

  傳代HPDLF細胞1 mL接種于12孔板,密度5×104/m L , 常規條件下培養至細胞融合 , 行分組實驗.室溫(25±2℃)下以濃度0.01 mol/L PBS行細胞快速沖洗,培養皿中加入鹽酸林可霉素藥液孵育,常規洗滌收集.超聲細胞粉碎機于冰浴條件下行細胞粉碎,超聲功率400W,循環操作30次,每次運行3s,各次間隔4s.裂解液高速離心后取上清液,應用孔徑0.22 μm的濾膜過濾處理,高效液相色譜儀下行色譜檢測[5].

  1.4 色譜條件

  實驗溫度(25±2)℃,實驗濕度(60±20)%.流動相應用孔徑0.45 μm濾膜于真空負壓條件下過濾后,超聲排氣.紫外檢測器,流速1ml/min,分析柱250mm×4.6mm5μm,柱溫30℃,進樣10μL,波長214nm[6].

  1.5 鹽酸林可霉素流動相

  濃度0.05mol/L PH值6.0的硼砂溶液、甲醇和乙腈混合液,配比比例分為5種:(1)75:20:5,(2)70:10:20,(3)60:20:20,(4)70:15:15,(5)70:17.5:12.5.對各配比的峰形、保留時間等參數進行比較分析,最終選取配比為70:17.5:12.5的混合液進行相關研究.

  1.6 蛋白濃度檢測

  細胞裂解液加入考馬斯亮藍染液充分混勻,于室溫下靜置10min,595nm紫外分光光度計測定吸光度,參照標準品濃度獲得標準曲線并計算蛋白濃度.各樣品均行3次檢測后,取平均值作為最終研究比較數值.

  1.7 統計學處理

  鹽酸林可霉素濃度與峰面積相關性應用線性回歸分析.PBS為空白對照組,不加藥細胞組樣本為陰性對照組,標準品為陽性對照組.各組樣本量超出3個.

  2 結果

  2.1 色譜學指標

  2.1.1 峰值 鹽酸林可霉素主成分峰保留時間為8.425min,主成分峰未受到進樣峰影響,表示分離度良好.空白對照組、陰性對照組于鹽酸林可霉素保留時間附近無峰值.

  2.1.2 線性關系 以藥物濃度為X軸、以峰面積為Y軸進行直線回歸分析,獲得回歸方程Y=-1.1883+1.3163X,濃度范圍2 μg/ml-80μg/ml,如圖1所示,藥物濃度與峰面積的線性關系良好.

  論文摘要

  2.1.3 回收率 分別對5μg/mL、20μg/mL和80μg/mL濃度的標準品進行檢測,每種濃度均備足3份分別檢驗,并取平均值作為研究結果.如表1所示為鹽酸林可霉素回收率情況,平均回收率96.71%,平均相對標準偏差(RSD)2.99%.

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  2.1.4 重復性 對1份樣品連續進行5次檢測,獲得平均相對標準偏差為2.69%.

  2.1.5 精密度 同日內間隔性進行標準品溶液的多次測定,日內相對標準偏差為2.52%,日間相對標準偏差為3.82%.

  2.2 胞內藥物濃度

  進行鹽酸林可霉素HPDLF細胞和MC3T3-E1細胞培養過程中,對濃度10μg/ml樣品分別于1、5、10 min時進行胞內藥物濃度檢測,結果均未發現細胞內有藥物存在;對濃度20μg/ml樣品分別于5、10 min時進行胞內藥物濃度檢測,仍未發現細胞內有藥物存在.

  3 討論

  牙周組織細胞在抗菌藥給藥環境下的跨膜轉運情況對于控制炎癥具有重要作用,該轉運過程有利于對細胞內感染各類細菌的抗菌治療.劉洪臣提出假說,認為根管以及牙周組織的通路給藥,可使藥物轉運至牙周局部組織乃至全身細胞組織[7].研究和探討相關抗菌藥的跨膜轉運情況對牙周局部和全身給藥的相關研究具有重要意義.

  Johnson等的研究認為林可霉素族藥物可在肺泡巨噬細胞中實現轉運[8],Klempner等研究氯林可霉素在中性粒細胞中可實現轉運[9],Hand等報道氯林可霉素可在單核細胞中轉運[10].但本組研究結果未發現鹽酸林可霉素在HPDLF中存在轉運,與相關報道有所差異,可能由于藥物結構、檢驗方法學、細胞類型等有關.藥物結構方面,盡管有研究指出林可霉素類抗菌藥在某些細胞中存在跨膜轉運,但目前鮮見對鹽酸林可霉素的具體研究,可能受到鹽酸林可霉素與其它林可霉素類用藥間的結核性差異影響;方法學方面,雖然波長檢測具有較好的抗菌藥物含量檢測效果,但其貼近于紫外檢測器下限,易造成流動相中乙腈等有機物的末端吸收,產生較大噪音,這可能是影響檢測靈敏度的因素之一;細胞類型方面,國內有研究檢測羅紅霉素、甲硝唑、替硝唑的HPDLF跨膜轉運情況,但無鹽酸林可霉素對HPDLF轉運的研究.目前抗菌藥在細胞間的轉運基質尚不明確,因而暫時無法明確HPDLF中抗菌藥無轉運的具體原因.

  當然,劉洪臣的報道僅為假說,也可能確實存在HPDLF和MC3T3-E1細胞無鹽酸林可霉素跨膜轉運的情況,是否可以通過根管及牙周組織的通路給藥使藥物轉運至牙周局部組織和全身以達到抗菌抗炎作用,仍需進一步研究分析探討.

  參考文獻

  1 劉貴臣. 牙周炎患者正畸治療過程中齦溝液及血清中多項白介素、PGE2、SICAM-1及PAK5水平的變化研究[J]. 中國醫藥導刊,2012;14(6):989~990

  2 江漫 , 趙紅 . 我院 2 0 0 9 年抗感染藥物不良反應報告分析 [ J ] . 中國醫藥導刊,2010;12(8):1397~1398

  3 劉宇,劉洪臣,吳霞,等. 人牙周膜成纖維細胞對甲硝唑替硝唑的跨膜轉運[J]. 口腔頜面修復學雜志,2007;8(2):90~93,96

  4 余立強,劉洪臣,吳霞,等. 人牙周膜成纖維細胞對甲硝唑攝取機制的研究[J]. 中華老年口腔醫學雜志,2009;7(2):71~75

  5 劉宇,劉洪臣,吳霞,等. 人牙周膜成纖維細胞對羅紅霉素的跨膜轉運[J]. 北京口腔醫學,2008;16(3):138~141

  6 邵蓓新,張穎,李建軍,等.毛細管電泳-電致化學發光法測定鹽酸林可霉素[J]. 鄭州大學學報(工學版),2011;32(4):99~102

  7 劉洪臣. 牙根管全身給藥假說[J]. 中華老年口腔醫學雜志,2007;5(1):2~3

  8 高云,鐘良軍,張源明,等. 慢性牙周炎合并動脈粥樣硬化兔動物模型的抗炎干預研究[J]. 中華實用診斷與治療雜志,2011;25(4):326~330

  9 梁菁,趙紅宇. 牙周炎與冠心病關系的研究進展[J]. 中華口腔醫學研究雜志(電子版),2011;5(3):328~332

  10 吳瑩瑩,劉洪臣.TNF-α、IL-1β及IL-6與糖尿病及牙周炎之間的關系[J].中華老年口腔醫學雜志,2011;9(2):117~121

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