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六肖中特免费管家:家畜養殖中基因編輯技術的運用

時間:2019-02-02 來源:農業生物技術學報 作者:謝曉剛,薛嘉,康健,葛 本文字數:20121字

六肖中特免费公开109 www.cffyz.icu   摘    要: 近年來出現的幾種以人工核酸酶為代表的新型基因編輯技術, 包括鋅指蛋白核酸酶 (zinc-finger nuclease, ZFN) 技術、轉錄激活因子樣效應核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 技術、成簇的規律間隔的短回文重復序列/CRISPR相關蛋白 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins, CRISPR/Cas) 系統, 在科學研究以及家畜育種等方面已被廣泛應用。這些基因編輯技術是通過特異性結構識別靶位點, 核酸酶發揮切割作用, 對靶位點進行定點編輯, 具有高效準確、制作簡單等特點。本文闡述了上述3種新型基因編輯技術的基本原理, 比較了不同基因編輯技術的差異, 總結了在主要家畜豬、牛、羊上的應用, 提出目前這三種基因編輯技術存在的主要問題, 并對這些技術的應用前景進行了展望。

  關鍵詞: 基因編輯; ZFN; TALEN; CRISPR/Cas; 家畜;

  Abstract: Several novel gene editing techniques have been applied in scientific research and livestock breeding in recent years, including zinc finger protein nuclease (ZFN) , transcriptional activator-like effector nuclease (TALEN) , clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins (CRISPR/Cas) system. These gene editing techniques site-directly edit genomes by recognizing the target sites according to the specific structure followed by endonuclease dissection, which is characterized by high efficiency, accuracy, and simple production. In this paper, we demonstrated the basic principles, differences and potential main problems of above three gene editing techniques, summarized the application in the main livestock pigs, cattle and sheep, and provided an outlook of the future of these techniques in application.

  Keyword: Gene editing; ZFN; TALEN; CRISPR/Cas; Livestock;

  基因編輯技術是指人為地對目的基因進行移除和定點插入的操作, 從而實現特定基因的敲除和敲入等?;蟣嗉際蹩梢允迪衷諳赴? 器官水平, 以及個體水平進行精確而有效的基因組編輯, 從而被廣泛應用于生物技術領域。

  在過去的數十年中, 一系列通過核酸內切酶介導的新型基因編輯技術被開發出來, 主要包括鋅指核酸酶 (zinc-finger nuclease, ZFN) 技術, 轉錄激活因子樣效應核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 技術和成簇的規律間隔的短回文重復序列相關核酸酶 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins, CRISPR/Cas) 系統。這三種核酸酶基于由序列特異性的DNA結合結構域與非特異性的DNA切割結構域組成 (Carroll, 2011;Urnov et al., 2010) 。他們通過特異性結合DNA序列, 產生雙鏈斷裂 (double-strand breaks, DSBs) , 啟動細胞自身DNA修復機制, 以非同源末端連接 (non-homologous end joining, NHEJ) 或者同源重組修復 (homology-directed repair, HDR) 的方式進行基因高效精確編輯 (Wyman, Kanaar, 2006) 。這三種新型基因編輯技術已經在細菌 (Shipman et al., 2017) 、酵母 (Saccharomyces cerevisiae) (Xie et al., 2018) 、人類 (Homo sapiens) 細胞 (Verma et al., 2017) 、食蟹猴 (Macaca fascicularis) (Yao et al., 2018) 、果蠅 (Drosophila melanogaster) (Denecke et al., 2017) 、斑馬魚 (Barchydanio rerio) (Zhang et al., 2017) 、爪蟾 (Xenopus laevis) (Delay et al., 2017) 、小鼠 (Mus musculus) (Nakasuji et al., 2017;Roper et al., 2018) 、擬南芥 (Arabidopsis thaliana) (Ryder et al., 2017) 、水稻 (Oryza sativa) (Yin et al., 2017) 、小麥 (Triticum aestivum) (Shan et al., 2013) 等多種生物體中得到了廣泛的研究和應用。在三種主要家畜動物豬 (Zheng et al., 2017) 、牛 (Gao et al., 2017;Wu et al., 2015) 、羊 (葛恒濤, 2016;朱紅梅, 2016) 上的應用, 近些年也取得了很大的進展。

  1 新型基因編輯技術介紹

  1.1 ZFN技術

  ZFN又稱鋅指蛋白核酸酶 (zinc-finger protein nuclease, ZFPN) , 是一種經過人工改造的核酸內切酶??蒲Чぷ髡?983年首次在非洲爪蟾卵母細胞的轉錄因子ⅢA中發現了與DNA具有特異性結合親和力的鋅指蛋白 (zinc finger protein, ZFP) (Mani et al., 2005) 。其在20世紀90年代末首次得到研究和應用 (Bibikova et al., 2003) , 從而實現了基因的高效定點編輯, 開創了基因修飾的先河。

家畜養殖中基因編輯技術的運用

  ZFN其結構主要由兩部分組成, 即ZFP構成的特異性DNA結合域 (DNA-binding domain) 和DNA切割域 (DNA cleavage domain) (Kim et al., 1996) 。DNA切割域由限制性內切酶FokⅠ演變而來, DNA結合域用于識別特定的DNA序列, 位于ZFN的N末端。含有大約30個氨基酸殘基的鋅指 (Zinc-finger, ZF) 是構成ZFP結構域的DNA結合基序 (DNA-binding motif) (Klug, 2010) ??梢越喔魴恐附峁棺樽暗揭黃? 用以識別更長的DNA序列。因此, 通常將3~6個Cys2His2類型的鋅指結構相結合, 組裝構成ZFP結構域, 其在DNA鏈上沿著3'到5'的方向與靶序列相結合 (Gaj et al., 2012) 。FokⅠ切割域位于ZFN的C末端, FokⅠ核酸酶發現于海床黃桿菌 (Flavobacterium okeanokoites) , 其在細菌體內通過二聚化發揮核酸內切酶的活性, 使目的基因位點產生雙鏈斷裂 (Palpant, Dudzinski, 2013) 。一對ZFN的兩個單體分別由其3'到5'以及5'到3'方向識別靶標DNA雙鏈, 兩個FokⅠ核酸酶切割域發揮切割作用, 特異性的打靶目的基因 (Hauschild-Quintern et al., 2013) 。鋅指核酸酶使用的關鍵是構建識別不同堿基的ZFP, 通過優化氨基酸的組成來達到基因精確編輯的目的。

  在基因編輯過程中, 把鋅指核酸酶的質粒載體導入細胞后, 載體上的核定位信號將會引導鋅指核酸酶進入細胞核, 鋅指DNA結合域將與目標序列發生特異性結合, FokⅠ切割域于兩個結合位點的間隔區切割產生DNA雙鏈斷裂 (Carroll, 2011) , 細胞可通過HDR或NHEJ方式產生基因敲除、點突變、基因敲入, 從而實現基因的定向修飾操作 (Kim, Kim, 2011) 。

  1.2 TALEN技術

  TALEN也是一種人工合成的核酸酶, 1989年轉錄激活樣效應因子 (trancription activator-like effector, TALE) 首次在感染植物的一種細菌—黃單胞菌 (Xanthomonas) 中被發現 (Bonas et al., 1989) 。TALE通過細菌Ⅲ類分泌系統進入細胞, 通過與特異基因啟動子結合來調節轉錄, 促進細菌的集落形成??蒲Чぷ髡囈玊ALE具有的特異性結合能力與FokⅠ核酸酶具有的切割能力相結合, 制作出了具有特異性基因組編輯能力的工具TALEN, TAL-EN技術由此產生, 并被迅速用于生物技術方面的研究, 逐漸取代了ZFN技術 (Bedell et al., 2012) 。

  與ZFN相類似, TALEN也由兩部分組成。一部分是TALE蛋白DNA結合結構域, 另一部分是與ZFN相同的FokⅠ核酸酶切割域, 前者負責目標序列的特異性識別, 后者進行靶位點的切割 (Moscou, Bogdanove, 2009) 。TALE由N端轉運信號、C端核定位信號、轉錄激活結構域和DNA結合結構域構成 (Deng et al., 2012;Ul et al., 2015) 。DNA結合結構域由多個重復序列組成, 每個重復序列由33~35個氨基酸組成, 其??檳詰牡?2和13位的氨基酸具有兩個多態性, 稱為雙氨基酸殘基 (repeat variable diresidues, RVD) (Osborn et al., 2013) 。鑒于該DNA結合結構域的??榛匭? 可以將具有不同特異性的RVD組裝成陣列以靶向特異性的DNA序列。FokⅠ核酸酶與TALE的C端相連, 通過識別特異的DNA序列, 對其進行定點切割, 引起DSBs, 并且啟動細胞自我修復機制, 以HDR或NHEJ的方式, 實現對特定基因的靶向修飾, 包括基因敲除、敲入和基因定點突變等 (Hinkley et al., 2011;Li et al., 2011) 。Carlson等 (2012) 將TALEN技術應用于豬 (Sus scrofa) 和牛 (Bos taurus) 的胚胎基因組編輯, 引起家畜基因組的的特定遺傳修飾, 包括單等位基因敲除、雙等位基因敲除以及基因敲入等等, 改變了家畜物種的遺傳學組成和基因組的結構和功能。TALEN基因編輯技術是一種嶄新的分子生物學工具, 被認為是基因編輯技術發展史上的里程碑, 是繼ZFN之后的第二代基因編輯技術, 被《Science》雜志評選為2012年度十大科學突破的新技術。

  1.3 CRISPR/Cas9技術

  Ishino等 (1987) 在大腸桿菌 (Escherichia coli) 中發現了成簇的規律間隔的短回文重復序列, 到2012年, 科學家才正式命名為CRISPR。后來又一種經過人工改造的核酸內切酶, 即CRISPR/Cas技術, 迅速在動物、植物、微生物上得到廣泛應用 (Nakasuji et al., 2017;Ryder et al., 2017;Xie et al., 2018) 。

  CRISPR/Cas系統兩部分構成, 即CRISPR和Cas核酸酶。CRISPR是指成簇的規律間隔的短回文重復序列 (Mojica et al., 2000) , 其序列由一個前導區 (leader) 、多個短的重復序列區 (repeat) 以及多個間隔區 (spacer) 構成 (Makarova et al., 2006) 。leader長度通常在400 bp左右, 其序列上富含A、T堿基, 負責啟動CRISPR序列的轉錄 (Sorek et al., 2008) 。repeat形成發卡結構, 含有長度為22~48 bp的回文序列 (Grissa et al., 2007) 。長度為26~73 bp的spacer將各個重復序列隔開 (Deltcheva et al., 2011;Karginov, Hannon, 2010) 。Cas核酸酶即CRISPR相關蛋白, 現在基因工程中最常用的核酸酶是Cas9蛋白, 該蛋白是一種多結構域核酸酶蛋白 (Mojica, Montoliu, 2016) 。

  CRISPR/Cas系統主要被分為三類:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。目前, 被廣泛應用的是來源于Ⅱ型的CRISPR/Cas9系統由Cas9核酸內切酶、CRISPR RNA (crRNA) 、反式激活crRNA (tracrRNA) 組成。Cas9核酸酶與兩種RNA成分形成復合物, crRNA在目標識別中發揮作用, 而tracrRNA在復合物形成過程中在crRNA成熟和Cas9蛋白的穩定中發揮重要的作用 (Jinek et al., 2012) 。crRNA和tracrRNA均具有非編碼能力并且彼此部分互補 (Feng et al., 2013) , 兩種RNA組分形成一種稱為單向導RNA (sgRNA) 的嵌合RNA (Doudna, Charpentier, 2014) 。Cas9核酸酶具有兩個獨立的Ruvc和HNH結構域, 當CRISPR/Cas9復合物與PAM (protospacer adjacent motif) 序列結合時, 這些結構域都被激活, HNH參與互補鏈的切割, 而Ruvc參與切割非互補鏈, 兩條鏈在重新接合后導致移碼突變或插入缺失 (Jinek et al., 2012) 。Csa9核酸酶行使功能最重要的區域是PAM序列區域, PAM序列涉及CRSIPR/Cas9復合物與靶區域的早期關聯, PAM基序的序列通常是NGG, 且存在于靶序列的下游區域 (Ran et al., 2015) 。現在, CRISPR系統組件已經簡化為兩部分, 即Cas9核酸內切酶和sgRNA (Doudna, Charpentier, 2014;Jinek et al., 2012;Ma et al., 2016) 。

  CRISPR/Cas系統的發展日新月異, 呈現了多元化發展的趨勢。2015年美國麻省理工學院張鋒團隊發現了類似于Cas9但結構更簡單的核酸酶—Cpf1, Cpf1不需要核糖核酸酶 (RNaseⅢ) 和tracrRNA便可獨自完成對crRNA的加工成熟過程 (Zetsche et al., 2015) 。該研究團隊還發現了一種只靶向和切割細菌內特異RNA序列的新型蛋白—C2c2 (Abudayyeh et al., 2016) 。C2c2作為一種新發現的針對RNA的分子生物學工具, 將被用于RNA的功能、運動和定位研究中。此外, 美國哈佛大學David Liu實驗室2016年首次發現了基于胞嘧啶脫氨酶與CRISPR/Cas9融合形成的單堿基編輯技術 (base editor, BE) , 該技術實現了胞嘧啶 (cytosine, C) 到胸腺嘧啶 (thymine, T) 的單堿基轉換 (Komor et al., 2016) 。2017年, 該實驗室再次取得重要進展, 建立了新的單堿基編輯系統, 實現了腺嘌呤 (adenine, A) 到鳥嘌呤 (guanine, G) 的精確轉換 (Gaudelli et al., 2017) 。這兩套系統在不引入DNA雙鏈斷裂也不需要重組修復模板的情況下可以實現對基因組更加安全、高效、精準的單堿基編輯, 而且其效率遠遠高于DSBs引起的HDR修復方式 (Gaudelli et al., 2017;Komor et al., 2016) 。近日, 伊利諾伊大學的一個研究團隊提出了一種稱為CRISPR-SKIP的通用方法, 該方法利用胞嘧啶堿基編輯器 (cytosine base editor, CBE) 控制基因剪接, 實現了靶基因處的外顯子跳躍。這意味著, CRISPR-SKIP可以在不引入DSBs情況下來消除突變的基因序列, 還能影響基因的表達和調控方式, 有望治療多種遺傳性疾病 (Gapinske et al., 2018) 。

  隨著第三代基因編輯技術CRISPR/Cas系統的橫空出世, 立刻成為了基因編輯歷史上的又一重要的里程碑。該技術克服了傳統的基因編輯技術的操作周期長、打靶效率低、應用范圍窄的缺點。CRISPR/Cas系統的不斷研發和多元化發展拓展了該技術的應用領域, 并且使該技術用起來更完美, 更簡單, 效率更高, 脫靶效應大大降低, 安全性更好, 成為目前基因編輯技術的主流方法和工具。

  2 三種新型基因編輯技術的優劣

  三種新型基因編輯技術 (ZFN, TALEN和CRISPR/Cas) 均能實現基因組的定點修飾和編輯, 應用范圍有很大程度的重合, 但是這三種技術在使用方面有不同的技術特點和適用范圍 (表1) 。ZFN技術最先發現, 研究應用時間比較長, 技術較為完善, 但ZFN的識別結構域中存在廣泛的上下文依賴效應, 在對ZFN的選擇方面還有很大的難度, 且成本較高, 產生較強的細胞毒性, 容易引起基因組中其他基因的突變以及染色體畸變 (Pattanayak et al., 2011;Radecke et al., 2010) 。TALEN技術相比ZFN技術, 其識別位點及選擇范圍變得較寬, 而且成本大大降低, 打靶效率顯著提高和細胞毒性顯著降低, 但是其限制因素是在識別位點前的第一個堿基必須是胸腺嘧啶, 且構建TALEN??楸冉細叢? 費時費力。最近幾年興起的CRISPR/Cas技術, 其打靶效率和適用性要比TALEN和ZFN技術高很多, 但是也不可避免的存在一些不足, 目前主要存在的問題是PAM序列的依賴性與脫靶效應 (Fu et al., 2013;Hsu et al., 2013) 。

  3 基因編輯技術在家畜上的應用

  3.1 在家畜抗病育種中的應用

  家畜疾病頻發給養殖業帶來了巨大的經濟損失, 是目前制約畜牧業發展的重要因素;人畜共患病的爆發同樣威脅著人類的安全。此外, 家畜疾病還帶來了一系列諸如環保、抗生素殘留以及食品安全等問題。人們逐漸意識到, 單純依靠防疫和藥物治療已無法徹底防控家畜疾病。近些年, 科學工作者將新型基因編輯技術應用于家畜抗病育種中去, 取得了很大的進展。

  表1 三種新型基因編輯技術的比較Table 1 Comparison in three new gene editing techniques
表1 三種新型基因編輯技術的比較Table 1 Comparison in three new gene editing techniques

  Richt等 (2007) 運用傳統的同源重組技術在牛體內敲除了朊蛋白基因 (prion protein gene, PRNP) , 使其腦部的PrPC蛋白表達顯著下調, 可以防止由朊蛋白造成的瘋牛病 (Mad cow disease) 的發生。筆者所在實驗室利用ZFN技術將外源的人溶菌酶基因和溶葡萄球菌素基因定點插入到牛酪蛋白位點 (CSN2) , 通過克隆技術獲得了對乳腺炎具有抗性的奶牛 (Liu et al., 2013;Liu et al., 2014) 。同時, 本實驗室還利用TALEN和CRISPR/Cas9技術, 將外源的SP110基因和NRAMP1基因定點插入到?;蜃? 生產出具有抗結核病功能的轉基因牛, 研究結果不僅對牛結核病的防御與控制有重大意義, 同時為動物抗病育種提供新思路 (Gao et al., 2017;Wu et al., 2015) 。有研究發現, 豬CD163蛋白是豬繁殖與呼吸綜合征 (porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 病毒感染豬肺泡巨噬細胞的主要受體 (Calvert et al., 2007) 。美國密蘇里大學Whitworth、英國愛丁堡大學羅斯林研究所Burkard以及浙江大學王少華等分別利用CRISPR/Cas9技術成功獲得了CD163基因敲除豬, 對PRRS病毒具有顯著抗性, 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 抗病豬的產生對于人類對抗對養豬業具有致命性打擊的繁殖與呼吸綜合征的發生具有重要意義 (Burkard et al., 2017;Whitworth et al., 2015;王少華等, 2018) 。

  3.2 在家畜生產性狀改良中的應用

  肌肉生長抑制素基因 (myostatin, MSTN) 是肌肉生長的負調控因子, 該基因的表達可抑制肌細胞的增殖與分化, 對該基因進行突變有利于肌肉的生長發育, 可以顯著增加肌纖維的直徑、提高肌纖維數量 (Mcpherron, Lee, 1997) 。Luo等 (2014) 利用鋅指核酸酶技術首次生產出MSTN基因敲除的牛, 這些牛表現出顯著的雙肌表型, 大大提高了肉牛的產肉量, 為高瘦肉率肉牛、肉羊等肉用家畜新品種培育奠定基礎。Wang (2015) 年報道應用CRISPR/Cas9技術, 將sgRNA和Cas9RNA共注射到絨山羊 (Capra hircus) 原核期胚胎, 經胚胎移植生產出了同時敲除FGF5基因和MSTN基因的山羊, 山羊被毛長度顯著增加, 且呈現雙肌表型, 實現了在山羊體內同時敲除多個基因, 加快了優質絨山羊的培育。在Yu等 (2016) 利用TALEN技術結合體細胞核移植技術靶向敲除了山羊體內的MSTN基因, 生產出了三只發育良好的敲除MSTN基因的山羊, 說明了TALEN技術同樣可以對山羊的基因組進行定向編輯, 為TALEN技術應用于山羊的育種提供了可能。Wang等 (2016) 利用CRISPR/Cas9系統結合原核注射技術在綿羊 (Ovis aries) 體內同時實現了MSTN、刺鼠信號蛋白基因 (agouti signal protein, ASIP) 和β-胡蘿卜素加氧酶2基因 (beta-carotene oxygenase 2, BCO2) 三基因靶向敲除, 且在潛在的脫靶位點未發現脫靶效應, 表明CRISPR/Cas9技術可以同時針對多個基因進行可遺傳修飾, 且有較低的脫靶效應, 達到有效改善家畜生產性能的目的。此外, 還有多家單位利用CRISPR/Cas9系統獲得了MSTN基因敲除的家畜動物 (Guo et al., 2016;Wang et al., 2017) , 并積極用于擴繁育種建群。

  不飽和脂肪酸ω-3有益于調整動物機體內部脂類代謝, ω-3脂肪酸脫氫酶表達由Fat-1基因調控, 使脂肪酸由ω-6形式轉變為ω-3。張駒等通過CRISPR/Cas9技術成功敲除了山羊的MSTN基因, 并且在該位點中定點插入了Fat-1基因, 生產出體內既可以高表達Fat-1基因, 提升羊肉中ω-3含量, 又能增加羊肉產量的絨山羊新育種材料 (張駒, 2016) 。角是牛、羊特有的組織結構, 在養殖過程中, 角容易損傷飼養人員, 而人為去角又會違背動物福利且費時費力。Tan等 (2013) 通過TALEN技術以無角安格斯牛1號染色體上重復202 bp為模板, 得到了經基因編輯的荷斯坦牛胎兒成纖維陽性細胞。隨后通過體細胞核移植技術成功獲得了無角荷斯坦牛, 加快了無角牛新品種的育種進程 (Carlson et al., 2016) 。由于豬體內缺乏功能性的UCP1 (Uncoupling protein 1) 基因, 導致仔豬體溫調節不良, 易受寒冷的影響, 2017年中科院動物所趙建國和金萬洙團隊合作使用CRISPR/Cas9系統, 將外源性小鼠UCP1基因定點插入到到豬內源性UCP1基因位點, 生產出的后代豬提高了產熱能力, 降低了新生崽豬由于受凍而死亡的可能, 使抗寒豬的育種邁出了堅實的一步 (Zheng et al., 2017) 。

  3.3 應用于家畜乳腺生物反應器研制

  動物乳腺生物反應器 (mammary gland bioreactor) 亦稱為轉基因動物乳腺個體表達系統, 是指利用哺乳動物乳腺特異性啟動子調控原件指導目的基因在乳腺中特異性表達, 以期從基因修飾動物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應器 (付玉華等, 2010) , 在牛、羊等家畜動物中具有廣泛的應用。

  Moghaddassi等 (2014) 年報道了利用TALEN技術結合體細胞核移植技術成功實現了人血清白蛋白 (human serum albumin, hSA) 基因在母牛乳腺中的高表達, 為大規模的生產質量可靠、價格便宜的人源性的血清白蛋白奠定了堅實的基礎。Peng等 (2015) 利用最新的CRISPR/Cas9技術, 將豬作為乳腺反應器動物生產出了乳腺中高表達人重組血清白蛋白的轉基因豬。Cui等 (2015) 利用TALEN技術以及體細胞核移植技術, 將人乳鐵蛋白基因 (human lactoferrin, hLF) 定點插入到奶山羊的β-乳球蛋白 (Beta lactoglobulin) 基因座, 實現了乳鐵蛋白在奶山羊乳腺中高表達, 不僅提高了羊奶的營養價值, 而且靶向沉默了β-乳球蛋白基因, 減少了新生兒的乳蛋白過敏反應。

  筆者所在實驗室朱紅梅 (2016) 同樣借助TAL-EN這種基因編輯工具, 利用同源重組手段將人乳白蛋白基因 (human lactalbumin, hLA) 定點插入到山羊β-乳球蛋白基因位點。葛恒濤 (2016) 利用TALE切口酶介導的基因打靶技術將口蹄疫病毒 (Foot and mouth disease virus, FMDV) 、豬瘟病毒 (Classical swine fever virus, CSFV) 和PRRSV等具有免疫原性的結構蛋白基因定點整合至山羊β-乳球蛋白基因座, 并通過體細胞核移植技術生產出了乳中可分泌抗病活性蛋白的轉基因乳腺反應器奶山羊。此外, 2017年中國農業大學劉國世課題組利用CRISPR/Cas9系統成功在山羊乳腺中過表達參與褪黑素合成的5-羥色胺-N-乙?;潑?(arylalkylamine N-acetyltransferase, AANAT) 基因和乙酰血清素甲基轉移酶 (acetylserotonin methyltransferase, ASMT) 基因, 獲得高褪黑素含量的功能乳, 為研究生產功能乳提供了研究基礎 (Ma et al., 2017) 。

  3.4 應用于家畜疾病動物模型的建立

  隨著新型基因編輯技術的不斷發展與完善, 其已廣泛的應用于家畜疾病動物模型的建立。PPAR-γ (Peroxisome proliferator-activated receptor-γ) 基因在人類心血管疾病的發病方面具有重要作用。Yang等 (2011) 利用ZFN技術結合體細胞核移植技術生產出了兩頭PPAR-γ基因敲除豬, 該模型的建立為人類進行心血管疾病基礎研究和治療奠定了基礎。低密度脂蛋白受體 (low-density lipoprotein receptor, LD-LR) 是導致家族性高膽固醇血癥的重要致病基因, 人類血清低密度脂蛋白升高可導致血液中膽固醇水平升高, 會增加動脈粥樣硬化與早發冠心病的風險。Carlson等 (2012) 通過TALEN技術結合體細胞核移植技術生產出了特異性的LDLR基因敲除小型豬, 建立了家族性高膽固醇血癥理想的實驗動物模型。Hai等 (2014) 利用CRISPR/Cas9系統和顯微注射技術成功地對豬的血管性血友病因子基因 (von Willebrand factor, vWF) 進行了靶向沉默, vWF基因突變可使豬體組織出血嚴重, 出現與血管性血友病相似的動物模型, 為該病的發病遺傳基礎研究以及治療研究提供了很好的實驗動物模型。

  賴良學課題組報道了通過CRISPR/Cas9系統獲得成活的酪氨酸酶基因 (tyrosinase, TRY) 敲除豬, TRY基因的敲除致使豬存在典型的白化病表型, 該研究對人類攻克白化病具有重要的應用價值 (Zhou et al., 2015) 。2018年, 該課題組與暨南大學李曉江教授、美國Emory大學李世華教授合作, 同樣應用CRISPR/Cas9技術將人源的突變亨廷頓基因 (Huntington, HTT) 基因定點插入到豬HTT基因座內, 經體細胞核移植技術生產出了表達人源性突變型HTT的基因編輯豬, 建立了神經退行性疾病亨廷頓病豬疾病模型 (Yan et al., 2018) 。該模型的建立突出體現了使用大型哺乳動物研究神經退行性疾病及其治療方法的重要性。帕金森綜合癥也是老年人中最常見的神經退行性疾病, 體內DJ-1, parkin和PINK1基因中隱性遺傳的功能喪失突變可能是導致帕金森綜合癥的重要病因 (Kitada et al., 1998;Lesage, Brice, 2009;Valente et al., 2004) 。Wang等 (2016) 利用CRISPR/Cas9技術構建出了同時針對巴馬小型豬中的三種不同的基因座parkin/DJ-1/PINK1的人帕金森綜合癥豬模型。

  3.5 其他方面的應用

  用豬的器官進行人的異體器官移植在克服人體器官嚴重不足方面具有巨大的應用潛能。臨床上, 在豬體內幾乎所有組織存在α-1, 3-半乳糖基轉移酶 (α-1, 3-galactosyltransferase, GGTA1) 基因所編碼的α-1, 3-半乳糖抗原 (α-1, 3-galactose, α-gal) , 此抗原是引起人與豬異種器官移植的超急性排斥反應 (hyperacute rejection, HAR) 的主要因素。Hauschild和Niemann (2011) 利用ZFN技術以及體細胞核移植技術首次實現了在豬體內GGTA1基因的雙等位基因敲除, 從而為豬-人的異種器官移植的實現邁出了可喜的一步。除了Gal之外, 單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經氨酸羥化酶 (cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH) 基因編碼的N-羥乙酰神經氨酸 (N-g1yco1ylneuraminicacid, Neu5Gc) 是另一種主要免疫抗原, Neu5Gc可在GG-TA1基因敲除豬體內廣泛表達 (Song et al., 2010) 。Lutz等 (2013) 同樣應用ZFN技術和體細胞核移植技術生產出具有GGTA1/CMAH雙基因敲除的豬, 并在體外證明了人體血清對GGTA1/CMAH雙基因敲除豬的免疫排斥反應相對單基因GGTA1敲除豬來說更小。Martens等 (2017) 利用CRISPR/Cas9技術生產出了同時敲除GGTA1、CMAH以及B4GALNT2 3個基因的豬, 人類血清對該豬異種免疫排斥反應顯著降低。這些特異性抗原敲除豬模型的建立, 將為最終培育出適用于臨床應用的豬器官奠定了基礎。

  在新型環保節糧豬的培育過程中, 華南農業大學吳珍芳團隊將四個來自微生物的酶類基因bg17A、eg1314、xynB以及eappA插入到豬的基因組, 培育出的轉基因豬新育種材料, 飼養過程中氮磷排出顯著減少, 同時節約精糧食, 生長速度快, 育肥出欄快, 有望緩解養豬業的環境污染和糧食消耗問題 (Zhang et al., 2018) 。

  4 前景與展望

  以ZFN、TALEN和CRISPR/Cas為代表的新型基因編輯技術, 已成為非常有價值的分子生物學工具。這三種基因編輯技術大大增強了研究和探索各種模式生物包括家畜動物的能力。研究人員借助這些分子工具, 能夠開發以家畜為代表的生物醫學疾病模型 (Yan et al., 2018) , 且在家畜的抗病育種 (Gao et al., 2017) 、性狀改良 (Wang et al., 2017) 、乳腺生物反應器 (Ma et al., 2017) 等方面具有重要的應用。

  相對于ZFN和TALEN技術, CRISPR/Cas系統以其更高的打靶效率和更低的成本, 顯示出廣泛的應用前景和靈活性。目前, 制約CRISPR/Cas系統發展的主要因素是脫靶效應及PAM序列的制約??蒲Чぷ髡囈辛撕芏嘌芯坷純朔廡┪侍?。在降低脫靶效應方面, 有研究發現增加或減少2~3個核苷酸的sgRNA能夠減少錯配率從而增加靶序列的專一性 (Fu et al., 2014;Kim et al., 2015) 。Doench等 (2016) 創造了新的sgRNA設計規則并建立了人類和小鼠的全基因庫, 用基因庫設計的sgRNA能夠有效減少CRISPR/Cas9系統的脫靶效應。Frock等 (2015) 將Cas9核酸酶改造為Cas9切口酶 (Cas9 nickase, nCas9) , nCas9能夠使Cas9蛋白的HNH或Ruv C結構域失活而形成單鏈斷裂 (single-strand breaks, SSBs) 以減少脫靶效應。Qi等 (2013) 把Cas9蛋白改造為Dead Cas9 (dCas9) , dCas9能夠使HNH和RuvC兩個活性位點均失活, sgRNA介導dCas9與靶序列結合可以抑制基因的起始轉錄從而降低脫靶脫靶效應。在克服PAM序列的依賴性方面, 有研究發現不同來源的Cas9蛋白可以識別不同的PAM序列, 比如SpCas9識別5'-NGG PAM, NmCas9識別5'-NNNNGATTPAM (Hou et al., 2013) , StCas9識別5′-NNAGAAPAM (Cong et al., 2013) , KKHsaCas9變體可以識別5'-NNGRRTPAM等 (Kleinstiver et al., 2015) 。此外, 2018年東京大學Osamu Nureki教授和麻省理工學院的張鋒教授報道了一個SpCas9變體SpCas9-NG, 可以識別5'-NGPAM (Nishimasu et al., 2018) 。Cas9蛋白的多樣性擴大了PAM區打靶目標范圍, 有助于選擇更為合適的靶位點。

  CRISPR/Cas技術已經發展為一個強大的基因編輯工具, 隨著其新系統如Cpf1、C2c2、BE等的不斷涌現, 并呈現多元化發展, 其已成為近幾年進行基因組編輯優先選擇的技術 (葛陸星等, 2017) 。隨著新型基因編輯技術的不斷研發拓展與完善, 以及三種技術的聯合應用, 在家畜育種、動物模型制作以及生物技術研究中必將得到廣泛應用, 推動畜牧業的整體發展。

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